Teknik Isolasi Meristem

Teknik Isolasi Meristem:

Peralatan:
a. LAF
b. Mikroskop binokuler dengan lampu
c. Pinset berujung runcing
d. Skalpel dan jarum suntik
Bahan:
a. Biji kedelai
b. Biji kedelai dikecambahkan secara aseptik
c. Media MS + 0,1 μm BA + 1,0 μm NAA (dapat menginduksi meristem menjadi tanaman lengkap).
Cara kerja:
a. Biji kedelai disterilkan dengan merendam ke dalam alkohol 70% selama 1 menit, dipindahkan kedalam 20% clorox selama 15 menit- 20 menit sambil digoyang, selanjutnya dibilas menggunakan aquadest steril 4x untuk menghilangkan sisa-sisa cloroxnya.
b. Biji tersebut dimasukkan ke dalam aquadest steril dan direndam selama 5-6 jam.
c. Biji-biji tersebut ditanam pada media MS dalam tabung reaksi 18x2,5 cm.
d. Kecambah umur 1 minggu diisolasi meristemnya dibawah mikroskop binokuler (yang telah disterilkan dengan alkohol 70%) pada perbesaran 20x10.
e. Organ daun dibuang secara hati-hati menggunakan skalpel atau jarum sampai terlihat meristem yang berbentuk kubah (dome). Dengan jarum atau ujung scalpel, dibuat irisan dengan bentuk V dengan ukuran 0,2-0,3 mm dan langsung meristem dimasukkan ke dalam media kultur yang telah disediakan.
f. Botol kultur diletakkan pada inkubator pada suhu 25-27oC dengan penyinaran selama 16 jam/hari.

Meristem Kentang

Persiapan bahan tanaman:
a. Umbi kentang yang mempunyai bobot 30 g/ buah atau umbi yang besar yang dipotong dengan berat 20 g/potong dengan beberapa mata.
b. Umbi direndam dalam 0,03 μm GA3 selama 1 jam.
c. Umbi diletakan pada pasir yang lembab.
d. Tunas yang 3-5 cm dipergunakan sebagai bahan awal.

Isolasi meristem:
a. Tunas dicuci bersih menggunakan detergen dan disterilkan dalam larutan clorox 20% selama 7 menit, direndam lagi dalam larutan clorox 10% selama 10 menit, selanjutnya dibilas menggunakan aquadest steril. Tunas dipindahkan pada petri-dish steril.
b. Tunas diambil bagian jaringan meristem dengan cara seperti pada pengambilan jaringan meristem pada kedelai.
c. Media yang digunakan adalah MS + 1 g/L Bacto-tryptone.
d. Botol kultur disimpan dalam inkubator pada suhu 25 oC, panjang penyinaran 12 jam /hari, intensitas cahaya 150 lux selama 7 minggu.
e. plantula yang telah dihasilkan diuji dengan ELISA test.
f. Bila telah bebas virus, plantula dapat disubkultur dengan memotong-motong 1 buku/ eksplan, dipindahkan ke madia MS + 0,001 mg/L dan diulangi prosedur tiak 20 hari, untuk mendapatkan plantula dalam jumlah banyak.


Kultur Meristem Anggrek Cymbidium

Cymbidium dapat dikulturkan pada beberapa media, seperti: media Vacint & went, Muller & Morel, MS ½ atau Knudson C. Tanaman ini dapat ditanaman dalam media cair (botol kultur diletakan di atas shaker dengan pengocokan) ataupun padat dengan penambahan agar 0,8%.
Isolasi bahan tanam:
 Pucuk Cymbidium dipotong sepanjang 3 cm, kemudian daun-daun yang menyelubungi dibuang.
 Pucuk direndam dalam alkohol 70% selama 2 menit dilakukan dua kali kemudia dibilas dengan air steril.
 Pucuk direndam ke dalam larutan clorox 20% selama 5 menit, bilas dengan air steri 2-3 kali dan selanjutnya direndam kembali ke dalam larutan clorox 10% selama 10 menit.
 Pucuk dibilas menggunakan aquadest steril, selanjutnya diletakkan pada cawan petri steril.
 Jaringan meristem yang berbentuk kubah (dome) diambil sekitar ukuran 0,5 mm dari titik tumbuh dengan 2 calon daun.
 Jaringan meristem diletakkan di dalam air steril dalam petri-dish. Jaringan tersebut kemudian dipindahkan pada media dalam botol kultur.

Tahapan kultur:
1. Kultur meristem anggrek dapat dibagi menjadi 3 tahap yang berkesinambungan, yaitu:
a. Inokulasi eksplan dan pembentukan protocorm awal.
b. Perbanyakan protocorm.
c. pembentukan calon tanaman sempurna (plantula).
2. Pada tahap pertama, eksplan diinokulasikan ke dalam media cair, selanjutnya botol kultur dikocok terus menerus menggunakan shaker, hingga eksplan membentuk massa protocorm, shaker diletakkan pada ruangan yang bersuhu 22oC dengan pencahayaan sekitar 100 f.c.
3. Tahap kedua, melakukan perbanyakan protokorm, yaitu dengan memotong-motong protocorm dan dipindahkan ke media segar. Tahap ke dua memerlukan waktu 2 bulan. Media yang digunakan dan pengocokkan dilakukan sama seperti pada tahap pertama.
4. Tahap ketiga adalah memperoleh calon tanaman sempurna (bibit) yaitu dengan perakaran tunas. Protocorm dari tahap ke dua dipanen dan diambil yang berukuran 0,5 cm (satu eksplan satu protocorm). Protocorm yang masih belum mencapai ukuran ditinggalkan dalam botol kultur untuk diperbanyak lagi. Protocorm dewasa dipindahkan dalam media padat, sehingga membentuk tunas dan akar. Bila plantula telah terbentuk sempurna dapat diaklimatisasi untuk dipindahkan ke lapangan

Baca Selengkapnya...

KULTUR ORGAN DAN KULTUR MERISTEM (MIKROPROPAGASI)

Kultur Organ

Teknik kultur jaringan semakin berkembang dan popular sebagai salah satu alternatif dari propagasi tanaman vegetatif. Teknik ini meliputi metode propagasi aseksual dan tujuan utamanya adalah membuat tanaman lebih unggul. Kesuksesan dari beberapa seleksi in vitro dan manipulasi genetic pada tanaman tingkat tinggi tergantung pada kesuksesan dari regenerasi tanaman in vitro.

Keberhasilan pertama dalam kultur in vitro dicapai dalam praktek kultur organ. Menurut Shabde – Moses & Murhasige (1979), Hannig, pada tahun 1904 telah berhasil mendapatkan kecambah tanaman jenis crucifer dari embrio-embrio yang diisolasi dari biji yang belum matang (immature). Pertumbuhan organ yang tidak terbatas didalam kultur in vitro, pertama diperlihatkan oleh White dalam kultur akar tomat sekitar tahun 1934.

Kultur organ merupakan topik yang penting dalam penelitian antara tahun 1940-1960. Setelah itu penalitian dalam bidang ini berkurang, kecuali kultur pucuk/meristem. Kultur pucuk atau maristem mempunyai aspek praktis sebagai cara perbanyakan klon yang cepat dan bebas penyakit. Dewasa ini kultur maristem sudah merupakan tindakan komersial yang dikelola oleh perusahaan –perusahaan pembibitan.

Disamping kultur pucuk, pada tahun 60 an, kultur akar mendapat perhatian lagi pada beberapa tanaman tertentu sehubungan dengan tujuan produksi bahan sekunder, terutama untuk jenis-jenis persenyawaan yang berasosiasi dengan akar. Namun kultur akar yang pertumbuhannya tidak terbatas tersebut, dewasa ini pada umumnya dipusatkan pada hasil transformasi dengan Agrobacterium rhizogenes yang merupakan kultur auksin autotroph.
Secara keseluruhan kultur organ dalam ilmu fisiologi dipergunakan dalam studi diferensiasi dan fungsi dari jaringan-jaringan khusus. Kebutuhan nutrisi dan lingkungan, dapat dieksplorasi antara lebih tepat dalam kultur in vitro. Organ-organ tanaman yang sering digunakan sebagai eksplan tergangtung dari jening tanamannya, organ tersebut antara lain adalah:

1. Jaringan meristem,
8. Helaian daun,
2. Pucuk,
9. Tuber rhizogenum
3. Pucuk kormus,
10. Tuber caulogenum
4. Buku kormus,
11. Inflorescentia,
5. Buku bulb
12. Mata Tunas samping
6. Buku batang tunggal,
13. Hipokotil dan epikotil
7. Ruas batang muda,
14. Akar

KULTUR MERISTEM

Kultur meristem (meristem culture) adalah kultur jaringan tanaman dengan menggunakan eksplan berupa jaringan-jaringan meristematik. Jaringan meristem yang digunakan dapat berupa meristem pucuk terminal atau meristem tunas aksilar. Dalam kultur meristem, perkembangan diarahkan untuk mendapatkan tanaman sempurna dari jaringan meristem tersebut dan dapat sekaligus diperbanyak.
Kultur meristem, sudah secara luas diterapkan untuk tujuan perbanyakan tanaman, terutama pada tanaman hortikultura. Sel-sel meristem pada umumnya stabil, karena mitosis pada sel-sel meristem terjadi bersama mericloneengan pembelahan sel yang berkesinambungan, sehingga ekstra duplikasi DNA dapat dihindarkan. Hal ini menyebabkan tanaman yang dihasilkan identik dengan tanaman donornya.

Selain dari perbanyakan, aplikasi kultur meristem yang terutama adalah eliminasi virus dari bahan tanaman dan penyimpanan plasma nutfah yang bebas virus ini dengan teknik Cryopreservation : preservasi dengan temperatur rendah (Kartha, 1981 dalam Gunawan 1988). Merurut Gautheret (1982 dalam Gunawan 1988), kultur meristem dan eliminasi virus, sejarahnya dimulai dari Stanley seorang biochemist yang menganjurkan White yang pada waktu itu bekerja dengan kultur akar tomat untuk menumbuhkan virus dalam akar yang di-isolir. Dalam subkultur, ada akar yang tidak mengandung virus, terutama bila eksplan yang diambil sangat kecil. Pada tahun 1952 Morel dan Martin berhasil memperoleh tanaman dahlia yang bebas virus dan kemudian berkembang pada banyak tanaman-tanaman lain.
Pada tahun 1960 Morel yang mencoba membebaskan tanaman Cymbidium dari virus, bahkan mendapatkan hasil yang merupakan dasar perbanyakan komersial sekarang. Kultur meristem Cymbidium, Morel dapat menghasilkan perbanyakan diri secara cepat. Tanaman yang dihasikan tersebut merupakan perkembangan dan pertumbuhan dari jaringan vegetatif, maka plantula yang dihasilkan merupakan suatu klon. Tanaman yang dihasilkan dari kultur meristem yang berupa klon sering disebut mericlone. Tahapan pertumbuhan dari kultur meristem Cymbidium dimulai dari terbentuknya kalus terlebih dahulu kemudian disusul terbentuknya protocorm (yaitu suatu struktur serupa dengan perkembangan awal dari perkecambahan biji anggrek yang sebelum tumbuh menjadi tanaman yang sempurna, menggerombol menjadi suatu massa protocorm. Bila massa protocorm tersebut dipisah-pisahkan dan ditumbuhkan di media serupa yang baru maka akan memperbanyak diri menjadi massa protocorm yang baru. Bila protocorm dipindahkan pada media lain yang mengarah pada pendewasaan dan perakaran maka protocorm akan tumbuh menjadi tanaman baru yang sempurna dan siap dipindah ke lapangan.
Hasil yang diperoleh Morel ini tidak hanya membuat revolusi dalam bidang peng-anggrekan, tetapi juga memberikan dorongan dalam perbanyakan cepat tanaman jenis lain. Murashige juga memberikan landasan bahwa kultur meristem dan kultur pucuk dapat digunakan sebagai teknik perbanyakan tanaman hortikultura. Sudah sekitar 10 tahun Murashige bekerja untuk mengembangkan teknik-teknik yang standard untuk beberapa jenis tanaman hias sampai tanaman buah-buahan. Metode yang digunakan untuk berbagai tanaman ini berbeda dengan anggrek. Penggunaan auksin dan sitokinin diperlukan dalam kultur-kultur yang kemudian dikembangkan. Bila Morel memperoleh banyak tanaman baru dari meristem pucuk anggrek dengan melewati proses pembentukan kalus terlebih dahulu, maka Hussey dan Stacey (1980 dalam Gunawan 1988) memperoleh tanaman baru kentang dengan teknik lain. Jutaan tanaman kentang baru diperoleh dalam jangka waktu yang cukup singkat yaitu sekitar satu tahun. Tunas kentang yang bebas virus dijadikan sebagai eksplan awal. Mula-mula satu tunas pucuk atau tunas ketiak kentang ditumbuhkan dalam media perbanyakan, sehingga tumbuh menjadi buku-buku yang masing-masing mengandung satu tunas ketiak. Selanjutnya setiap empat minggu, tunas itu dipanen dan dipotong-potong menjadi buku-buku tunggal atau beberapa buku (3-4 buku) untuk dukulturkan lagi ke dalam media baru. Demikian seterusnya 4 minggu dilakukan kultur berulang.
Perbanyakan vegetatif yang menggunakan eksplan yang telah terinfeksi virus akan menjadi penyebab tersebarnya virus dalam anakan (progeni) di lapangan. Penularan melalui benih sering terjadi pada tanaman Fabaceae seperti buncis, ercis, dan kedelai.
Perkembangbiakan virus sangat tergantung pada metabolisme sel tnaman inang, antara virus dan sel inang terdapat hubungan yang erat. Proses eliminasi virus melalui cara-cara kemoterapi tidak selalu berhasil. Cara yang paling efisien adalah menggunakan kultur meristem. Beberapa contoh tanaman yang berhasil dibersihkan dari virus dengan kultur meristem ditampilkan pada tabel berikut ini:


Teknik Isolasi Meristem
Peralatan:
LAF
Mikroskop binokuler dengan lampu
Pinset berujung runcing
Skalpel dan jarum suntik
Bahan:
Biji kedelai
Biji kedelai dikecambahkan secara aseptik
Media MS + 0,1 μm BA + 1,0 μm NAA (dapat menginduksi meristem menjadi tanaman lengkap).
Cara kerja:
Biji kedelai disterilkan dengan merendam ke dalam alkohol 70% selama 1 menit, dipindahkan kedalam 20% clorox selama 15 menit- 20 menit sambil digoyang, selanjutnya dibilas menggunakan aquadest steril 4x untuk menghilangkan sisa-sisa cloroxnya.
Biji tersebut dimasukkan ke dalam aquadest steril dan direndam selama 5-6 jam.
Biji-biji tersebut ditanam pada media MS dalam tabung reaksi 18x2,5 cm.
Kecambah umur 1 minggu diisolasi meristemnya dibawah mikroskop binokuler (yang telah disterilkan dengan alkohol 70%) pada perbesaran 20x10.
Organ daun dibuang secara hati-hati menggunakan skalpel atau jarum sampai terlihat meristem yang berbentuk kubah (dome). Dengan jarum atau ujung scalpel, dibuat irisan dengan bentuk V dengan ukuran 0,2-0,3 mm dan langsung meristem dimasukkan ke dalam media kultur yang telah disediakan.
Botol kultur diletakkan pada inkubator pada suhu 25-27oC dengan penyinaran selama 16 jam/hari.

Meristem Kentang
Persiapan bahan tanaman:
a. Umbi kentang yang mempunyai bobot 30 g/ buah atau umbi yang besar yang dipotong dengan berat 20 g/potong dengan beberapa mata.
b. Umbi direndam dalam 0,03 μm GA3 selama 1 jam.
c. Umbi diletakan pada pasir yang lembab.
d. Tunas yang 3-5 cm dipergunakan sebagai bahan awal.
Isolasi meristem:
Tunas dicuci bersih menggunakan detergen dan disterilkan dalam larutan clorox 20% selama 7 menit, direndam lagi dalam larutan clorox 10% selama 10 menit, selanjutnya dibilas menggunakan aquadest steril. Tunas dipindahkan pada petri-dish steril.
Tunas diambil bagian jaringan meristem dengan cara seperti pada pengambilan jaringan meristem pada kedelai.
Media yang digunakan adalah MS + 1 g/L Bacto-tryptone.
Botol kultur disimpan dalam inkubator pada suhu 25 oC, panjang penyinaran 12 jam /hari, intensitas cahaya 150 lux selama 7 minggu.
plantula yang telah dihasilkan diuji dengan ELISA test.
Bila telah bebas virus, plantula dapat disubkultur dengan memotong-motong 1 buku/ eksplan, dipindahkan ke madia MS + 0,001 mg/L dan diulangi prosedur tiak 20 hari, untuk mendapatkan plantula dalam jumlah banyak.


Kultur Meristem Anggrek Cymbidium

Cymbidium dapat dikulturkan pada beberapa media, seperti: media Vacint & went, Muller & Morel, MS ½ atau Knudson C. Tanaman ini dapat ditanaman dalam media cair (botol kultur diletakan di atas shaker dengan pengocokan) ataupun padat dengan penambahan agar 0,8%.
Isolasi bahan tanam:
Pucuk Cymbidium dipotong sepanjang 3 cm, kemudian daun-daun yang menyelubungi dibuang.
Pucuk direndam dalam alkohol 70% selama 2 menit dilakukan dua kali kemudia dibilas dengan air steril.
Pucuk direndam ke dalam larutan clorox 20% selama 5 menit, bilas dengan air steri 2-3 kali dan selanjutnya direndam kembali ke dalam larutan clorox 10% selama 10 menit.
Pucuk dibilas menggunakan aquadest steril, selanjutnya diletakkan pada cawan petri steril.
Jaringan meristem yang berbentuk kubah (dome) diambil sekitar ukuran 0,5 mm dari titik tumbuh dengan 2 calon daun.
Jaringan meristem diletakkan di dalam air steril dalam petri-dish. Jaringan tersebut kemudian dipindahkan pada media dalam botol kultur.
Tahapan kultur:
Kultur meristem anggrek dapat dibagi menjadi 3 tahap yang berkesinambungan, yaitu:
a. Inokulasi eksplan dan pembentukan protocorm awal.
b. Perbanyakan protocorm.
c. pembentukan calon tanaman sempurna (plantula).
Pada tahap pertama, eksplan diinokulasikan ke dalam media cair, selanjutnya botol kultur dikocok terus menerus menggunakan shaker, hingga eksplan membentuk massa protocorm, shaker diletakkan pada ruangan yang bersuhu 22oC dengan pencahayaan sekitar 100 f.c.
Tahap kedua, melakukan perbanyakan protokorm, yaitu dengan memotong-motong protocorm dan dipindahkan ke media segar. Tahap ke dua memerlukan waktu 2 bulan. Media yang digunakan dan pengocokkan dilakukan sama seperti pada tahap pertama.
Tahap ketiga adalah memperoleh calon tanaman sempurna (bibit) yaitu dengan perakaran tunas. Protocorm dari tahap ke dua dipanen dan diambil yang berukuran 0,5 cm (satu eksplan satu protocorm). Protocorm yang masih belum mencapai ukuran ditinggalkan dalam botol kultur untuk diperbanyak lagi. Protocorm dewasa dipindahkan dalam media padat, sehingga membentuk tunas dan akar. Bila plantula telah terbentuk sempurna dapat diaklimatisasi untuk dipindahkan ke lapangan

Baca Selengkapnya...

Bahan Pemadat dan Bahan Lain Dalam Media Kultur Taringan Tanaman

BAHAN PEMADAT
Agar
Bahan pemadat yang paling banyak digunakan adalah agar. Keuntungan dari pemakain agar adalah :
1. Agar membeku pada temperatur ≤ 45o C dan mencair pada temperature 100o C, sehingga dalam kisaran temperatur kultur, agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil.
2. Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman.
3. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media.

Agar merupakan campuran polisakharida yang diperoleh dari beberapa spesies Algae. Dalam analisa unsur diperoleh data, bahwa kandungan agar meliputi unsur Ca, Mg, K, dan Na dalam jumlah yang sedikit (Debergh, (1982 dalam Gunawan 1988). Kekentalan media pada umumnya meningkat secara linier oleh pertambahan konsentrasi agar. Kekentalan media juga dipengaruhi oleh :
a. Merek agar yang digunakan, merek agar yang berbeda, memberikan kekentalan yang sedikit berbeda walaupun beratnya sama.
b. pH media.
c. Penambahan arang aktif. Arang aktif 0.8-1 g/l menghambat pembekuan agar (Horner et al (1977 dalam George & Sherrington, 1984).

Dalam perbanyakan komersial dan percobaan-percobaan yang tidak dimaksudkan untuk mempelajari metabolisme sel, penggunaan agar murni bukan suatu keharusan mengingat harga agar murni sangat tinggi. Bahan-bahan yang tidak diinginkan dari agar, dapat dihilangkan dengan cara perendaman dalam aquadest selama 24 jam. Agar kemudian dibilas dengan ethanol dan dikeringkan dalam oven pada 60o C selama 24 jam.

Konsentrasi agar yang diberikan berkisar antara 0.6-1.0 %. Konsentrasi agar yang terlalu tinggi dapat mengurangi difusi persenyawaan dari dan ke arah eksplan sehingga pengambilan hara dan zat tumbuh berkurang, sedangkan zat penghambat dari eksplan tetap berkumpul di sekitar eksplan (Deberg, (1982 dalam Gunawan 1988).

Selain agar, akhir-akhir ini dikembangkan juga zat pemadat lain yang juga merupakan polisakharida, tetapi diisolasi dari mikroorganisme jenis yang lain. Gelrite yang diproduksi oleh Kelco, merupakan polisakharida yang dihasilkan dari bakteri Pseudomonas sp.

Beberapa sifat gelrite yang berlainan dengan agar adalah:
1. Gelrite membentuk gel yang lebih bening dari agar.
2. Untuk mencapai kekentalan gel tertentu, pemakaian gelrite lebih rendah dari agar, pada umumnya konsentrasinya hanya 2 gram/l media, Namun kekentalan gel dari gelrite sangat dipengaruhi oleh kehadiran garam-garam seperti NaCl, KCl, MgCl2, 6H2O dan CaCl2. Garam NaCl dan KCl menurunkan kekentalanan gel, tetapi MgCl2 dan CaCl2 meningkatkan kekentalan gel.

Arang Aktif (Charcoal)

Arang aktif atau charcoal adalah arang yang sudah dipanaskan selama beberapa jam dengan menggunakan uap atau udara panas (George & Sherrington, 1984). Bahan ini mempunyai sifat adsorpsi yang sangat kuat. Arang aktif dapat ditambahkan ke dalam media pada berbagai tahap perkembangan kultur. Bahan ini dapat ditambahkan pada media inisiasi, media regenerasi, atau media perakaran.

Penambahan arang aktif dapat membantu pertumbuhan perkembangan kultur, tergantung dari jenis kulturnya. Secara umum, pengaruh arang aktif adalah sebagai berikut:
1. Mengadsorpsi persenyawaan-persenyawaan toxic yang terdapat dalam media yang dapat menghambat pertumbuhan kultur, seperti :
a. Persenyawaan-persenyawaan fenolik dari jaringan yang terluka waktu inisiasi.
b. Persenyawaan 5-hidroksimetil furfural yang diduga terbentuk dari gula yang berada dalam larutan asam lemah dan mengalami pemanasan dengan tekanan tinggi (Nitsch et al, 1968 dalam Gunawan 1988).
2. Mengadsorpsi zat pengatur tumbuh sehingga:
a. Mencegah pertumbuhan kalus yang tidak diinginkan, seperti dalam androgenesis dan pucuk yang ingin diakarkan.
b. Membantu embryogenesis kultur dalam media regenerasi tanpa auksin, mungkin dengan bertindak sebagai sink yang menarik auksin dari dalam sel sehingga embryogenesis dapat terjadi (Drew, (1979 dalam George & Sherringtone, 1984).
3. Merangsang perakaran dengan mengurangi tingkat cahaya yang sampai ke bagian eksplan yang terdapat dalam media.
Arang aktif ditambahkan dengan konsentrasi yang bervariasi yakni 0.5-6 %, tergantung dari tujuan. Dalam media yang ditambahkan arang aktif, harus diusahakan agar arang aktif terbagi rata dalam media. Sesudah sterilisasi dalam autoklaf botol media harus sering dikocok sampai agar mulai membeku. Bila tidak diadakan pengocokan, maka hampir semua arang aktif berada di lapisan bawah media.

pH Media

Faktor penting lain adalah pH yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor :
1. Kelarutan dari garam-garam penyusun media
2. Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain
3. Efisiensi pembekuan agar.

Sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5.5-5.8 (Gamborg dan Shyluk, 1981). Tanaman Ericaceae seperti Rhododendron pengaturan pH, biasa dilakukan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCl pada waktu semua komponen sudah dicampur, beberapa saat sebelum disterilkan dengan autoklaf. Sekalipun media sudah ditetapkan, seringkali setelah sterilisasi pH-nya berubah. Pada umumnya terdapat penurunan pH setelah distrerilkan dalam autoklaf. Untuk mencapai pH sekitar 5.7-5.9, Nann dkk. (dalam George dan Sherrington, 1984) membuat pH 7.0 dalam media yang belum disterilkan.

Untuk menghindarkan perubahan pH yang cukup besar. Murashige dan Skoog menyarankan agar dilakukan pemanasan untuk melarutkan agar-agar dan memanaskan media didalam autoklaf selama beberapa menit, baru diadakan penetapan media disterilkan dalam autoklaf. Dalam wadah yang besar, media disterlkan dan kemudian dititrasi dengan NaOH/HCl steril sampai pH yang diinginkan. Setelah itu media dituang ke dalam wadah kultur steril yang telah dipersiapkan di dalam laminar air flow cabinet.

Buffer (chelating agent)

Penambahan asam amino seringkali juga bersifat sebagai buffer organik. Penambahan KH2PO4 sendiri tidak efektif sebagai buffer. Banyak peneliti terdahulu seperti Tausson dan Kordan (George & Sherringtone, 1984) menyarankan untuk menambahkan Fe SO4 dan Na-EDTA dalam media untuk bertindak sebagai buffer.

Baca Selengkapnya...

Peran Senyawa Organik Kompleks

Disamping golongan persenyawaan organik yang konstitusinya jelas, kadang-kadang dalam media kultur jaringan, juga ditambahkan persenyawaan yang kompleks yang dimaksud adalah: air kelapa, casein hydrolysate, ekstrak ragi, juice tomat, ekstrak kentang dan ekstrak pisang.
Air kelapa. Penggunaan air kelapa pertama kali dilaporkan oleh van Overbeek (1941 dalam Gunawan 1988) dalam kultur embrio Datura stramonium. Pada tahun-tahun berikutnya (1942 dalam Gunawan 1988). Gautheret menemukan bahwa air kelapa dapat digunakan untuk mempertahankan pertumbuhan jaringan yang diisolasi dari sumber yang berlainan. Pada tahun 1948, Caplin & Steward memperoleh pertumbuhan kalus yang lebih baik pada media dengan 5 % air kelapa dan casein hydrolysate dari pada media dengan IAA.
Penelitian yang lebih mendalam, menemukan bahwa efek air kelapa pada pertumbuhan menjadi lebih baik, bila dalam media juga diberikan auksin. Auksin tertentu dan air kelapa, dapat bersifat sinergis. Steward dan Caplin (1951 dalam Gunawan 1988) mendapatkan bahwa antara 2,4-D dan air kelapa terjadi reaksi sinergistik yang memacu pertumbuhan kalus Daucus carota.

Gambar 7. Kelapa ‘Genjah’ hijau, air kelapa yang digunakan untuk tambahan media kultur yang bagus berasal dari kelapa muda yang berwana hijau.

Namun tidak semua auksin dan air kelapa mempunyai kerja sama yang sinergis. Lin & Staba (1961 dalam Gunawan 1988) menemukan bahwa pada pertumbuhan kalus peppermint dan spearmint, penambahan air kelapa dalam media yang mengandung 2,4-D meningkatkan pertumbuhan kalus, sedangkan dengan 2-benzothiazoleoxyacetic acid, tidak.
a.

Casein hydrolysate. Dalam media yang tidak mengandung ion ammonium, penambahan asam amino dapat memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis. sumber asam amino campuran yang relative murah adalah casein hydrolysat dan ekstrak ragi. Dalam kultur jagung, Green et al (1974 dalam Gunawan 1988) menemukan bahwa penambahan ekstrak ragi 800 mg/l atau casein hydrolysate 200 mg/l memperbaiki pertumbuhan kalus, walaupun dalam media sudah ada ion ammonium seperti media Linsmaier & Skoog.
Penambahan casein hydrolysate dalam media regenerasi padi, meningkatkan jumlah pucuk yang terbentuk dalam kalus padi. Dalam kasus padi ini, penambahan asam amino yang sama dengan sam amino dalam casein hydrolysate tidak menghasilkan pengaruh yang sama. Hal ini disebabkan ada persenyawaan lain yang penting dalam casein hydrolysate. Casein hydrolysate yang diberikan pada konsentrasi 200-300 mg/l (Inoue & Maeda, 1982 dalam George & Sherringtone, 1984).
Ekstrak ragi. Penggunaan bahan organik ini pada kultur jaringan dalam percobaan-percobaan awal seperti pertumbuhan akar. Ekstrak ragi juga menyumbangkan asam amino, peptida, vitamin, untuk pertumbuhan kultur. Konsentrasi yang digunakan dalam kultur berkisar antara 0.5 gram/l sampai 2 gram/l.
Juice tomat dan ekstrak pisang, banyak digunakan untuk kultur embrio anggrek. Dalam perkembangan komposisi media, penambahan bahan-bahan yang underfined ini dihindarkan, karena bahan-bahan organic ini dapat berbeda bila varietas tanaman berbeda. Lingkungan tumbuh, nutrisi tanaman, dan sebagainya, mempengaruhi kandungan persenyawaan-persenyawaan tersebut. Hasil yang diperoleh di suatu saat, kadang-kadang tidak dapat diulangi lagi (unreproducable).
Juice orange yang ditambahkan ke dalam media kultur, ternyata dapat memacu pertumbuhan eksplan dengan pesat pada beberapa jenis Citrus
Ekstrak kentang digunakan dalam kultur anther padi. Penambahan ekstrak kentang kedalam media, dengan nyata meningkatkan pertumbuhan kalus dan regenerasi anther beberapa jenis padi (Zhou et al, (1966 dalam Gunawan 1988). Ekstrak kentang biasanya digunakan setara 10-30 % dengan hasil terbaik 20 %. Tetapi tidak dijelaskan tentang kentang yang dipergunakan. Juice tomat, ekstrak pisang, dan ekstrak kentang. Bahan-bahan ini pada umumnya merupakan sumber gula, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan asam amino.

ZAT PENGATUR TUMBUH
Zat pengatur tumbuh adalah senyawa organic komplek alami yang disintesis oleh tanaman tingkat tinggi, yang berpengaruh pada pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Dalam kultur jaringan, ada dua golongan zat pengatur tumbuh yang sangat penting adalah sitokinin dan auksin. Zat pengatur tumbuh ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan dan organ. Interaksi dan perimbangan antara zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam media dan yang diproduksi oleh sel secara endogen, menentukan arah perkembangan suatu kultur. Penambahan auksin atau sitokinin eksogen, mengubah level zat pengatur tumbuh endogen sel. Level zat pengatur tumbuh endogen ini kemudian merupakan trigerring factor untuk proses-proses yang tumbuh dan morfogenesis. Selain auksin dan sitokinin, gliberelin dan persenyawaan-persenyawaan lain juga ditambahkan dalam kasus-kasus tertentu.
Auksin. Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk merangsang kalus, suspensi sel dan organ.
Pemilihan jenis auksin dan konsentrasi, tergantung dari :
1. Tipe pertumbuhan yang dikehendaki.
2. Level auksin endogen.
3. Kemampuan jaringan mensintesa auksin.
4. Golongan zat tumbuh lain yang ditambahkan.

Auksin alamiah adalah Indola Acetic Acid (IAA), Level auksin dalam eksplan, tergantung dari bagian tanaman yang diambil dan jenis tanamannya. Selain itu juga dipengaruhi oleh musim dan umur tanamannya. Dalam kultur in vitro ada sel-sel yang dapat tumbuh dan berkembang tanpa auksin seperti sel-sel tumor. Sel-Sel ini disebut sel-sel yang habituated.
Pengaruh auksin terhadap pertumbuhan jaringan tanaman diduga melalui dua cara :
2. Menginduksi sekresi ion H+ keluar sel melalui dinding sel. Pengasaman dinding sel menyebabkan K+ diambil dan pengambilan ini mengurangi potensial air dalam sel. Akibatnya air masuk ke dalam sel dan sel membesar.
3. Mempengaruhi metabolisme RNA yang berarti metabolisme protein, mungkin melalui transkripsi molekul RNA. Auksin sintetik yang sering digunakan dalam kultur jaringan tanaman tercantum di dalam tabel di bawah.
4. Memacu terjadinya dominansi apikal.
5. Dalam jumlah sedikit memacu pertumbuhan akar.

Sitokinin. Golongan sitokinin adalah turunan dari adenine. Golongan ini sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis. Seperti juga auksin, sitokinin ada yang alamiah dan sintetis. Sitokinin yang pertama ditemukan, adalah kinetin yang diisolasi oleh. Skoog dalam laboratorium Botany di University of Wisconsin. Kinetin diperoleh dari DNA ikan Herring yang diautoklaf dalam larutan yang asam. Persenyawaan dari DNA tersebut sewaktu ditambahkan ke dalam media untuk tembakau, ternyata merangsang pembelahan sel dan differensiasi sel. Persenyawaan tersebut kemudian dinamakan kinetin. Fungsi sitokinin terhadap tanaman antara lain adalah:
Memacu terbentuknya organogenesis dan morfogenesis.
Memacu terjadinya pembelahan sel.
Kombinasi antara auxin dan sitokinin akan memacu pertumbuhan kalus.

Baca Selengkapnya...

Macam-Macam Media Kultur Jaringan

Macam-macam Formulasi Media Kultur

Formulasi media kultur jaringan pertama kali dibuat berdasarkan komposisi larutan yang digunakan untuk hidroponik, khususnya komposisi unsur-unsur makronya. Unsur-unsur hara diberikan dalam bentuk garam-garam anorganik. Koposisis media dan perkembangan formulasinya didasarkan pada jenis jaringan, organ dan tanaman yang digunakan serta pendekatan dari masing-masing peneliti. Beberapa jenis sensitif terhadap konsentrasi senyawa makro tinggi atau membutuhkan zat pengatur tertentu untuk pertumbuhannya. Pada periode tahun 1930an, formulasi media terutama ditujukan untuk menumbuhkan akar, tuber dan kambium. Media untuk penumbuhan akar yang dikembangkan oleh White (1934 dalam Gunawan 1988), pertama White menggunakan media yang berisi garam anorganik, yeast ekstrak dan sucrose, tetapi kemudian yeast ekstrak digantikan dengan 3 macam vitamin B, yaitu pyridoxine, thiamine dan nicotinic acid (Chawla, 2002).

Kultur kalus biasanya ditumbuhkan pada media dengan konsentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar. Nobecourt (1937) dalam George & Sherrington, 1984), menggunakan setengah konsentrasi dari larutan Knop yang biasa digunakan untuk hidroponik, digunakan juga untuk menumbuhkan kalus wortel. Pada media Knop sumber karbon berupa glucosa dan dan vitamin berupa cysteine hydrochloride. Media White juga dikembangkan oleh Hildebrant dkk (1946 dalam Gunawan 1988), dengan memodifikasi unsur-unsur makro yang lebih tinggi dibandingkan pada media kultur tembakau, media ini media ini digunakan mengkulturkan jaringan tumor tembakau dan bunga matahari. Konsentrasi untuk NO3- K + lebih tinggi dibandingkan pada media White, namun konsentrasi tersebut masih lebih rendah dibandingkan media yang lain yang banyak digunakan pada kultur jaringan sekarang, sedangkan kandungan unsur P, Ca, Mg dan S pada media tumor matahari, sama dengan media untuk jaringan tanaman pada umumnya seperti pada media yang dikembangkan sekarang. Perbaikkan formulasi media yang penting adalah pengembangan unsur makro yang universal, untuk mendukung pertumbuahan jaringan tumbuhan. Dalam media perlu ditambahkan ammonium dengan meningkatkan konsentrasi NO3- dan K +.

Media Knop dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA (Dodds and Roberts, 1983).

Media White dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang.

Media Knudson dan media Vacin and Went, media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm.
Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Mereka mengambil kesimpulan, bahwa NH4+ sangat menunjang pertumbuhan kalus tembakau (Miller et al, (1956 dalam Gunawan 1988).

Pertumbuhan sel dari jaringan suatu organ dibandingkan dengan jaringan tumor tanaman Venca rosea (Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan ammonium ke dalam media White yang sudah dimodifikasi, mempunyai pertumbuhan yang lebih baik. Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang diperoleh, hampir sama dengan yang dikembangkan oleh Miller (Wood & Braun (1961 dalam Gunawan 1988).

Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsemtrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media :
1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.
2. Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya.
3. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra.

Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan, maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap.

Media Gamborg B5 (media B5) pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968).

Media Schenk & Hildebrant (media SH) merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil (Trigiano & Gray, 2000). Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume.

Media WPM (Woody Plant Medium) yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon.
Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar pada umumnya diambil dari nama penemunya atau peneliti yang menggunakan pertama kali dalam kultur khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya.

Beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain:
1. Media dasar Murhasige dan skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur, terutama pada tanaman herbaceous.
2. Media dasar B5 untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain.
3. Media dasar White (1934) yang sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat.
4. Media dasar Vacin dan Went yang biasa digunakan untuk kultur jaringan anggrek.
5. Media dasar Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel.
6. Media dasar schenk dan Hildebrandt (1972) atau media SH yang cocok untuk kultur jaringan tanaman-tanaman monokotil.
7. Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM)
8. Media N6 untuk serealia terutama padi.

Dari sekian banyak media dasar yang paling sering dan banyak digunakan adalah komposisi media dari Murashige dan Skoog. Kadang-kadang untuk kultur tertentu, kombinasi zat kimia dari murashige dan Skoog masih tetap digunakan tetapi konsentrasinya yang diubah. Sebagai contoh media ½ MS, berarti konsentrasi persenyawaan yang digunakan adalah setengah konsentrasi media MS. Tabel 2. memperlihatkan sususnan persenyawaan dalam beberapa komposisi media dasar.

Baca Selengkapnya...

Media Kultur Jaringan Tanaman

Perkembangan yang sangat pesat tentang media nutrisi untuk pertumbuhan sel tanaman dimulai sejak tahun 1960-an dan 1970-an. Nutrisi dasar untuk kultur sel tanaman pada dasarnya mirip dengan nutrisi yang dibutuhkan oleh tanaman itu sendiri. Namun, variasi komposisi nutrisi tergantung pada sel-sel, jaringan-jaring, organ-organ dan protoplasma serta jenis tanaman yang akan dikulturkan. Sebelum pembuatan nutrisi media, satu hal yang sangat penting untuk diketahui terlebih dahulu adalah mengetahui tipe kultur yang mana yang akan digunakan, misalnya: kalus, sel, organ atau protoplas yang akan diteliti serta tujuan akhir dari penelitian tersebut. Tipe kultur yang berbeda akan mempunyai satu atau lebih komposisi media yang unik.
Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat bergantung pada media yang digunakan. Media kultur jaringan tanaman menyediakan tidak hanya unsur hara makro dan mikro, tetapi sumber karbohidrat yang pada umumnya berupa gula menggantikan karbon yang biasanya dihasilkan dari atmosfer melalui melalui proses fotosintesis.
Hasil yang lebih baik dapat dijangkau/ diperoleh, bila ke dalam media tersebut ditambahkan vitamin-vitamin, asam amino solid dan zat pengatur tubuh. Walaupun sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-komponen yang tidak jelas (komponennya) seperti juice buah-buahan dan tauge, air kelapa, yeast exstracts dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa memperoleh hasil yang lebih tinggi dengan penambahan tersebut. Sebagai contoh, air kelapa masih sering digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian, sedangkan pisang masih merupakan komponen tambahan yang sangat popular pada media anggrek.


Fasilitas dan Peralatan Yang Digunakan Dalam
Pembuatan Media

Peralatan yang digunakan untuk pembuatan media antara lain, adalah:
Autoklaf atau dandang presto.
Timbangan analitik digital.
Kertas tissue, aluminium foil, plastik wrap, kertas wrap, label.
Peralatan gelas untuk kultur jaringan tanaman, antara lain: botol kultur, gelas piala, erlenmeyer, cawan petri, gelas arloji, gelas pengaduk, gelas ukur, labu ukur, pipet dan lain-lain.
Desikator.
Unit filter disponsible.
Kulkas dan freezer.
Magnetik stirrer yang dilengkapi dengan hot plate.
Microwave, oven atau kompor gas.
Trolley atau rak dorong,
pH meter atau pH stick.
Vortek.
Sumber air (Air sumur atau PDAM) dan sumber arus listrik.
Water bath yang dilengkapi pengontrol temperatur.


Persiapan Membuat Larutan Dalam Satuan (Unit)

Konsentrasi dari satu substrat tertentu dalam media dapat digambarkan dalam variasi satuan (unit) adalah sebagai berikut ini:
Satuan Berat digambarkan sebagai milligram per liter (mg/l atau dapat ditulis sebagai mgL-1.
10-6 = 1,0 mg/l atau 1 part per million (ppm) atau seper juta bagian.
10-7 = 0,1 mg/l
10-9 = 0,001 mg/l atau µg/l

Satuan Konsentrasi.
Satu molar larutan (M) suatu senyawa sama dengan massa molekul dalam gram per liter.
1 molar (M) = massa molekul dalam g/l.
1 mM = massa molekul dalam mg/l atau 10-3 M.
1 µM = massa molekul dalam µg/l atau 10-6 M atau 10-3 mM.

Konversi dari mili molar (mM) ke mg/l.
Sebagai contoh, massa molekul auxin : 2,4 D = 221,0.
1 M larutan 2,4 D berisi 221,0 g/l.
1 mM larutan 2,4 D berisi 0,221 g/l = 221,0 mg/l
1 µM larutan 2,4 D berisi 0,000221 g/l = 0,221 mg/l

Konversi dari mg/l ke mili molar (mM)
Massa molekul CaCl2. 2H2O = 40.08 + 2 x 35..453 + 4 x 1.008 + 2 x 16 = 147.018
Massa atom: Ca = 40.08 ; Cl = 35..453 ; H = 1.008; O = 16
Jika 440 mg/l CaCl2. 2H2O akan di konversikan ke nM, maka:

Jumlah mg dari CaCl2. 2H2O
Jumlah mM CaCl2. 2H2O =
Massa molekul dari CaCl2. 2H2O

440
=
147.018

= 2.99 mM

Jadi 440 mg/l CaCl2. 2H2O = 2.99 mM.


Komposisi Media
Unsur hara di dalam media kultur tersusun atas beberapa komponen, sebagai berikut :
1. Hara makro yang digunakan pada semua formulasi media kultur.
2. Hara mikro selalu digunakan. Ada beberapa komposisi media yang hanya menggunakan besi atau besi-kelat.
3. Vitamin-vitamin dan asam-asam amino serta N organik, umumnya ditambahkan dalam jumlah yang bervariasi.
4. Sumber energi dan karbon berupa gula, merupakan keharusan, kecuali untuk tujuan yang sangat khusus.
5. Persenyawaan-persenyawaan organik kompleks alamiah seperti: air kelapa, ekstrak ragi (yeast extract), juice pisang hijau, tauge, nanas, kentang dan sebagainya.
6. Zat Pengatur Tumbuh (ZPT): ada beberapa jenis, antara lain: auxin, sitokinin, geberelin, asam absisat, etilin dan sebagainya. ZPT merupakan komponen penting dalam media kultur jaringan. Jenis dan konsentrasi ZPT yang digunakan sangat tergantung pada jenis taman dan tujuan dari kultur tersebut.
7. Buffer (chelating agent).
8. Bahan Pemadat. Bahan ini digunakan untuk membuat media padat, yang biasa digunakan adalah agar.
9. Arang aktif, berfungsi untuk menyerap senyawa toxic yang dihasilkan oleh eksplan sebagai anti oxidan juga sering digunakan untuk memacu pertumbuhan akar.

Baca Selengkapnya...

Sejarah Budidaya/Kultur Jaringan Tumbuhan

Tokoh-tokoh yang berperan dalam sejarah dimulainya pengetahuan kultur jaringan antara lain adalah:
1. Orang yang melakukan kultur jaringan adalah Gottlieb Haberlant pada tahun 1902.
2. Tahun 1904 Hannig melakukan kultur embrio pada tanaman cruciferae.
3. Knudson berhasil mengecambahkan anggrek secara in vitro di tahun 1922, pada tahun yang sama Robbins mengkulturkan ujung akar secara in vitro.
4. Gautheret, nobecourt dan White yang menemukan auxin dan telah berhasil membudidayakan kalus pada tahun 1939.
5. Skoog dkk. telah menemukan sitokinin dan orang pertama yang sukses dalam melakukan kultur jaringan pada tahun 1939.
6. Tahun 1940 Gautheret melakukan ku.ltur jaringan kambim secara in vitro pada tanaman Ulmus untuk study pembentukan tunas adventif.
7. Tahun 1941 Penggunaan air kelapa untuk campuran media dalam kultur Datura oleh van Overbeek.
8. Pembentukan tunas adventif pertama pada kultur tembakau secara in vitro oleh Skoog pada tahun 1944.
9. Baru pada tahun 1946, tanaman lengkap pertama dapat dihasilkan dari eksplan kultur tunas ujung pada Lupinus dan Tropaeolum oleh Ball.
10. Pada tahun 1950 Ball mencoba menanam jaringan kalus tanaman Sequoia sempervirens dan dapat menghasilkan organ.
11. Muir berhasil menumbuhkan tanaman lengkap dari kultur sel tunggal pada tahun 1954.
12. Tahun 1955 Miller dkk. Menemukan kinetin yang dapat memacu pembelahan sel.
13. Produksi tanaman haploid pertama dihasilkan oleh Guha pada tahun 1964.
14. Laminar air flow digunakan pertamakali pada akhir tahun 60-an.
15. Power mencoba melakukan penyatuan (fusi) protoplas pertama kali pada tahun 1970.
16. Baru pada tahun 1971 tanaman lengkap dihasilkan dari eksplan protoplas oleh Takebe.
17. Untuk mendapatkan tanaman yang tahan penyakit, Larkin pada tahun 1981 mengadakan penelitian variasi somaklonal yang pertama kali.
18. Salah satu cara untuk mendapatkan kultuvar unggul adalah dengan melakukan transformasi. Transformasi sel pertama dilakukan oleh Horch pada tahun 1984.
19. Trasformasi tanaman pertama dilakukan oleh IPTC pada tahun 1986.
20. Transformasi wheat oleh Vasil pada tahun 1992.
21. Pada tahun 1996 pelepasan pertama tanaman hasil transformasi genetik.

Baca Selengkapnya...

Pengantar Ilmu Kultur Jaringan Tanaman

Kultur jaringan bila diartikan ke dalam bahasa Jerman disebut Gewebe kultur atau tissue culture (Inggris) atau weefsel kweek atau weefsel cultuur (Belanda).
Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atau organ yang serba steril, ditumbuhkan pada media buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam kondisi yang aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbayak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap.

Dasar teori yang digunakan adalah teori totipotensi yang ditulis oleh SCHLEIDEN dan SCHWANN (Suryowinoto dan Suryowinoto, 1977) yang menyatakan bahwa teori totipotensi adalah bagian tanaman yang hidup mempunyai totipotensi, kalau dibudidayakan di dalam media yang sesuai, akan dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang sempurna, artinya dapat bereproduksi, berkembang biak secara normal melalui biji atau spora.
Teknik kultur jaringan menuntut syarat-syarat tertentu yang harus dipenuhi dalam pelaksanaannya. Syarat pokok pelaksanaan kultur jaringan adalah laboratorium dengan segala fasilitasnya. Laboratorium harus menyediakan alat-alat kerja, sarana pendukung terciptanya kondisi aseptik terkendali dan fasilitas dasar seperti, air listrik dan bahar bakar.

Pelaksanaan kultur jaringan memerlukan juga perangkat lunak yang memenuhi syarat. Dalam melakukan pelaksanaan kultur jaringan, pelaksana harus mempunyai latar belakang ilmu-ilmu dasar tertentu yaitu botani, fisiologi tumbuhan ZPT, kimia dan fisika yang memadai. Pelaksana akan berkecimpung dalam pekerjaan yang berhubungan erat dengan ilmu-ilmu dasar tersebut. Pelaksana akan banyak berhubungan dengan berbagai macam bahan kimia, proses fisiologi tanaman (biokimia dan fisika) dan berbagai macam pekerjaan analitik. Kadang-kadang latar belakang pengetahuan tentang mikrobiologi, sitologi dan histologi. Pelaksana juga dituntut dalam hal ketrampilan kerja, ketekunan dan kesabaran yang tinggi serta harus bekerja intensif.

Pekerjaan kultur jaringan meliputi: persiapan media, isolasi bahan tanam (eksplan), sterilisasi eksplan, inokulasi eksplan, aklimatisasi dan usaha pemindahan tanaman hasil kultur jaringan ke lapang. Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius, karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri.

Dalam bahasan ini akan dibicarakan tentang beberapa pengetahuan antara lain tentang:
1. Sejarah Budidaya Jaringan Tumbuhan
2. Landasan Kultur Jaringan
3. Tipe-tipe Kultur Jaringan
4. Istilah-istilah Dalam Kultur Jaringan
5. Peranan Kultur Jaringan
6. Bahan Bacaan

Baca Selengkapnya...

Tahapan Kultur Jaringan Tanaman

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.

Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional.

Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah:
1) Pembuatan media
2) Inisiasi
3) Sterilisasi
4) Multiplikasi
5) Pengakaran
6) Aklimatisasi

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.

Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.

Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.

Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).

Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.

Keunggulan inilah yang menarik bagi produsen bibit untuk mulai mengembangkan usaha kultur jaringan ini. Saat ini sudah terdapat beberapa tanaman kehutanan yang dikembangbiakkan dengan teknik kultur jaringan, antara lain adalah: jati, sengon, akasia, dll.

Bibit hasil kultur jaringan yang ditanam di beberapa areal menunjukkan pertumbuhan yang baik, bahkan jati hasil kultur jaringan yang sering disebut dengan jati emas dapat dipanen dalam jangka waktu yang relatif lebih pendek dibandingkan dengan tanaman jati yang berasal dari benih generatif, terlepas dari kualitas kayunya yang belum teruji di Indonesia. Hal ini sangat menguntungkan pengusaha karena akan memperoleh hasil yang lebih cepat. Selain itu, dengan adanya pertumbuhan tanaman yang lebih cepat maka lahan-lahan yang kosong dapat c

KEUNTUNGAN PEMANFAATAN KULTUR JARINGAN

- Pengadaan bibit tidak tergantung musim

- Bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dengan waktu yang relatif lebih cepat

- Bibit yang dihasilkan seragam dan memiliki sifat sama dengan induknya (true to tipe)
- Bibit yang dihasilkan bebas penyakit (menggunakan organ tertentu)

- Biaya pengangkutan bibit relatif lebih murah dan mudah

- Dalam proses pembibitan bebas dari gangguan hama, penyakit, dan deraan lingkungan

lainnya.

KULTUR jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untukmembuat bagian tanaman (akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuhmenjadi tanaman utuh (sempurna) dikondisi invitro (didalam gelas). Keuntungan dari kultur jaringan lebih hemat tempat, hemat waktu, dan tanaman yang diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat sama atau seragam dengan induknya.

Jadi tidak ada kata tidak untuk perbanyakan tanaman melalui berbagai tahapan kultur jaringan untuk menghasilkan bibit yang berkualitas.

Baca Selengkapnya...