RUANG ISOLASI DAN PENANAMAN

Ruang isolasi sering diistalahkan dengan ruang steril atau ruang tabur. Ruangan ini untuk skala laboratories biasanya tidak begitu luas karena biasanya berisi satu laminar air flow yang diperuntukkan untuk seorang atau dua orang bekerja di dalamnya, akan tetapi untuk skala industri ruangan ini biasanya luas atau sangat luas tergantung berapa kapasitas orang yang bekerja sacara bersama-sama seperti gambar dibawah ini.
Ruang penabur harus selalu terjaga kebersihannya atau kesterilannya. Setiap akan dan selesai kegiatan penanaman eksplan selalu dibersihkan dan disterilkan menggunakan alcohol 70% atau spiritus, terutama pada meja laminar air flow, sedangkan lantai dan dinding ruangan dibersihkan dengan larutan pembersih lantai yang dilengkapi oleh desinfektan.
Di dalam ruangan Laminar air flow biasanya dilengkapi dengan lampu UV untuk sterilisasi ruangan di dalam LAF tersebut. Alat-alat yang selalu tersedia di dalam ruangan penabur selain LAF, adalah lampu Bunsen, hand sprayer, peralatan untuk isolasi eksplan yang sudah disterilkan dan rak dorong.

Gambar 10. Contoh ruangan penabur untuk skala industri

Teknik kultur jaringan akan berhasil sukses bila dikerjakan di dalam laboratorium yang bersih dan steril, ruangan yang kering dan dilengkapi untuk memproteksi spora udara dari mikroorganisme. Sangat dianjurkan ruangan selalu bebas dari debu, sebelum melakukan segala aktifitas. Kultur jaringan tanaman harus diinkubasikan di bawah kondisi temperatur, pencahayaan, fotoperiode, kelembaban dan sirkulasi udara yang terkontrol.
Ruang inkubasi kultur biasanya merupakan ruang besar dengan kemungkinan perluasan bila diperlukan. Pertambahan kultur terjadi secara periodik disebabkan pertumbuhan satu jenis atau penambahan jenis kultur baru. Kultur yang tumbuh dan telah memperbanyak diri, secara teratur harus disubkultur. Tergantung dari jenis tanaman dan besarnya wadah kultur, subkultur dapat dilakukan setiap 4-6 minggu sekali. Hal ini berarti tiap bulan ada pelipatan jumlah kultur.
Botol kultur, biasa diatur pada rak-rak terbuka yang bersusun untuk menghemat area. Jarak antara tiap lapisan rak pada umumnya 40-50 cm. Jarak antara rak harus diatur sedemikian rupa sehingga memudahkan lalu lintas pemeriksaan kultur. Di dalam ruang kultur pada keadaan tersusun di rak, lingkungan fisik pertumbuhan diatur sedemikian rupa sehingga mendukung pertumbuhan yang optimal. Studi yang sistematik tentang efek lingkungan ruang kultur untuk tiap tahap pertumbuhan eksplan, sangat jarang dilakukan. Namun secara garis besar, ruang kultur harus mempunyai pengaturan terhadap temperatur dan cahaya.
Eksplan memang sudah dipenuhi kebutuhan karbohidrat dari gula dan media, sehingga cahaya untuk keperluan fotosintetis tidak begitu mendesak, tetapi cahaya amat penting untuk pengendalian perkembangan eksplan. Unsur-unsur dari cahaya yang perlu diperhatikan adalah kwalitas cahaya, panjang penyinaran, dan intensitas cahaya. Temperatur ruang kultur juga menentukan respon fisiologi kultur dan kecepatan pertumbuhannya.
Kualitas cahaya. Cahaya putih merupakan cahaya yang baik untuk pertumbuhan kultur. Lampu fluorescent biasa digunakan sebagai sumber cahaya dalam ruang kultur. Keseimbangan spektrum lampu fluorescent sangat baik dan sangat efisien dalam penggunaan energi bila dibandingkan dengan lampu pijar. Bentuk lampu memungkinkan penyebaran cahaya yang baik, dengan panas yang dikeluarkan relatif rendah. Pada lampu pijar, hampir 90 persen merupakan energi panas sehingga mempengaruhi temperatur ruangan. Kadang-kadang pada kultur tertentu, campuran cahaya dari lampu pijar dan fluorescent memberi pertumbuhan yang lebih baik.
Intensitas cahaya. Intensitas cahay yang baik dari lampu fluorescent adalah antara 1000-400 ft-c (1000-4000 lux). Murashige menyatakan bahwa pengaruh penyinaran dalam pertumbuhan asparagus, Gerbera, dan Saxifraga secara in vitro, yang terbaik dalah 1000 ft-c untuk multiplikasi tunas, dan 300-1000 ft-c untuk perakaran tunas. Intensitas cahaya diatur dengan menempatkan jumlah lampu dengan kekuatan tertentu pada jarak antara 40-50 cm dari tabung kultur, untuk luas area tertentu.
Panjang penyinaran. Total cahaya yang dibutuhkan suatu tanaman merupakan fungsi dari periode penyinaran. Berapa lama cahaya harus diberikan, tergantung dari jenis tanaman dan respon yang diinginkan. Ada kultur yang membutuhkan penyinaran terus-menerus, tapi banyak juga penelitian yang memperoleh hasil bahwa penggunaan panjang penyinaran selama 14-16 jam memberikan hasil yang baik. Pada tanaman tertentu membutuhkan penyinaran 10 jam, dan sebagainya. Panjang penyinaran diatur dengan alat automatic time switch atau lebih umum disebut timer.
Temperatur. Temperatur di dalam ruang kultur diharapkan dapat diatur. Bila dapat, temperatur antara periode gelap dan terang diatur berbeda sehingga proses fisiologis yang diinginkan dapat terjadi. Banyak laporan menyatakan bahwa temperatur yang baik untuk pertumbuhan tanaman dalam in vitro antara 25-280 C yang merupakan suhu ruangan normal. Beberapa perlakuan khusus kadang-kadang membutuhkan suhu yang rendah, misalnya untuk pengumbian pada kultur kentang, suhu yang diperlukan adalah 18-20o C. Suhu ruangan di negara tropis dapat diturunkan dengan pemasangan AC. Pemakain AC mutlak, karena ruang kultur merupakan ruang tertutup yang sedikit sekali mempunyai aliran udara bebas.
Alat-alat yang diperlukan dalam ruang kultur adalah :
1. Rak-rak kultur 3-4 tingkat dengan lampu fluorescent atau lampu TL.
2. Timer untuk mengatur lama penyinaran.
3. AC dan remote untuk mengatur temperature.
4. Mikroskop binokuler dan mikroskop inverted.
5. Alat-alat penunjang (kertas millimeter, penggaris, alat pembesar, dan sebagainya).
6. Shaker horizontal dan fermentor.
7. Tangga-tangga pendek untuk keperluan memeriksa kultur di rak yang tinggi.

Baca Selengkapnya...

Tata Tertib Dan Keselamatan Kerja di Dalam Laboratorium Kultur Jaringan

Tata Tertib Dan Keselamatan Kerja di Dalam Laboratorium Kultur Jaringan

1. Jumlah orang yang di dalam ruangan kultur jaringan usahakan sesedikit mungkin atau yang berkepentiangan saja, usahakan tidak sampai berjubel-jubel.
2. Usahakan ruangan selalu bersih dari barang-barang yang kotor, barang yang kotor usahakan untuk segera dicuci atau dibersihkan.
3. Tidak diperkenankan menyimpan atau melakukan kegiatan makan dan minum di Ruang penabur/ steril dan ruang inkubator
4. Pastikan sebelum meninggalkan ruang inkubator pintu inkubator dalam keadaan tertutup rapat.
5. Semua bahan kimia yang masih baru dan akan dibuka harus diberi label: inisial nama pembuka dan tanggal dibukanya tutup segel tersebut. Begitu juga bila menyimpan larutan kimia atau larutan stok yang baru dibuat, harus diberi label: Nama senyawa, konsentrasi dan tanggal dibuat lalutan.
6. Hati-hati dalam membuang pecahan pipet pastur, peralatan gelas, bekas jarum suntik, sebaiknya diletakkan dalam wadah tersendiri yang aman dari jangkauan orang.
7. Hemacytometer harus dicuci menggunakan alkohol 70% dan dibungkus sebelum disimpan, jangan ditinggalkan disembarang tempat.
8. Usahakan bersihkan tempat kegiatan (meja) dari tumpahan cairan atau serpihan bahan tanam atau media dengan menggunakan alkohol 70% dan jangan meninggalkan meja dalam keadaan kotor, pastikan selesai tepat pada waktunya, sehingga tidak merepotkan orang yang akan bekerja setelah anda.
9. Jangan lupa mengisi buku kerja lab yang telah tersedia di lab. Apa yang telah dikerjakan pada hari, tanggal dan jam tersebut.
10. Jangan menggunakan pipet yang masih tertutup kapas, pastikan kapas dibuka terlebih dahulu sebelum digunakan.
11. Letakan semua peralatan yang telah digunakan dan telah dicuci pada tempatnya bila tidak tahu atau tidak dapat meletakkan pada tempatnya, bertanyalah atau minta tolonglah kepada laboran untuk membantunya.
12. Ruang di dalam kulkas sangat terbatas, aturlah tempat media anda sehingga tidak memenuhi isi kulkas.
13. Usahakan jangan menggunakan larutan stok orang lain tanpa permisi, bila ingin menggunakannya hendaknya bertanya dan minta izin terlebih dahulu.
14. Tekan off laminar air flow setelah selesai kegiatan dan tekan on pada lampu UV setelah meja LAF dibersihkan.
15. Usahakan seminimal mungkin membuka dan menutup ruang incubator.
16. Sebelum bekerja bila menggunakan sarung tangan jangan lupa sarung tangan disemprot menggunakan alcohol 70% atau spiritus. Bila tidak menggunakan sarung tangan maka telapak tangan harus dilap dengan alcohol 70% atau disemprot spiritus terhebih dahulu sebelum bekerja.
17. Pastikan semua peralatan seperti skalpei, pinset, cawan Petri, botol kultur disemprot menggunakan alcohol 70% atau spiritus.
18. Bila kultur terkontaminasi, kuiltur tersebut segera dikeluarkan dari ruang incubator dan tutup aluminium foil tidak diperkenankan dibuka diruang inkubator tersebut.


Pemakaian Alat dan Instrument Lab
Pastikan bila anda tahu cara mengoperasikannya, bila belum tahu tata caranya mintalah bantuan kepada laboran untuk membantu anda.

Penggunaan Timbangan Analitik/mikro
Pintu dorong timbangan pastikan tertutup bila timbangan tidak digunakan.
Setelah menimbang, bersihkan piringan timbangan dan ruangan disekitar piringan dengan menggunakan kuas atau sikat. Jangan pernah membebani piringan jika timbangan tidak digunakan.
Tidak boleh menimbang barang melebihi 100 gram atau kapasitas untuk timbangan mikro.

Penggunaan pH Meter
Letakan pH-meter pada keadaan standby on jika tidak dipakai; jangan ditekan off.
Siramlah electrode dengan aquadest perlahan sebelum digunakan. Siramlah electrode dengan aquadest kembali sesudah digunakan dan letakan pada silinder kembali.
Jangan dibiarkan elektrode diluar larutan pada waktu yang lama.


Ruang stok sangat diperlukan untuk menyimpan larutan stok makronutrien, mikronutrien, senyawa khelat (Fe-EDTA), vitamin dan zat pengatur tumbuh. Pada skala laboratories ruang stok cukup kulkas (refrigerator), freezer, akan tetapi untuk skala industri dibutuhkan ruangan yang lebih besar, sehingga ruang ini berupa kamar yang berukuran sesuai kebutuhan, misalnya berukuran 3 x 3 x 3 m3 .
Untuk meningkatkan efisiensi kerja dalam pelaksanaan kultur jaringan, keperluan dalam tiap tahapan kerja sudah direncanakan terlebih dahulu. Sebelum pekerjaan penanaman baru dan subkultur rutin dilakukan, media tumbuh sudah dipersiapkan minimum 3 hari sebelum diperlukan. Media-media yang dipersiapkan ini harus disimpan di ruang yang dingin dan gelap. Ruang untuk penyimpanan media-media yang disediakan ini disebut ruang stok. Ruang stok harus berhubungan langsung 2 arah, satu arah dengan ruang persiapan dan arah lain dengan ruang transfer. Kebersihan ruangan harus diperhatikan. Tidak ada alat-alat yang diletakkan dalam ruang stok, Hanya perlu rak-rak untuk meletakkan media. Larutan stok yang sudah mengalami pengendapan atau terkontaminasi sebaiknya tidak digunakan lagi dan segera dikeluarkan dari ruang stok supaya tidak memenuhi ruangan.

Baca Selengkapnya...

Laboratorium dan Organisasi Kultur Jaringan

Dalam kultur jaringan, pertumbuhan eksplan atau inokulum diusahakan dalam lingkungan aseptik dan terkendali. Implikasi dari keadaan ini adalah bahwa setiap langkah dalam pelaksanaanya harus dilakukan dalam laboratorium. Laboratorium yang efektif merupakan salah satu unsur penting yang ikut menentukan keberhasilan suatu kegiatan, baik untuk keperluan peneletian, maupun produksi. Laboratorium kultur jaringan sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehingga setiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainya, tetapi juga saling berhubungan dan mudah dicapai.

Penataan ruangan dalam laboratorium, dikaitkan dengan langkah-langkah dalam prosedur kultur jaringan dan alat-alat yang diperlukan. Kegiatan kultur jaringan di dalam laboratorium, dibagi dalam 3 kelompok yaitu : (1) Persiapan media dan bahan tanaman. (2) Isolasi dan penanaman. (3) Inkubasi dan penyinaran kultur.
Masing-masing kegiatan harus terpisah satu dengan lainya, dengan peralatan yang tersendiri, karena kegiatan-kegiatan tersebut, maka ruangan yang dibutuhkan adalah :
1. Ruang persiapan dan ruang stok
2. Ruang isolasi dan penanaman.
3. Ruang kultur.
4. Ruang kantor.
5. Ruang mikroskop atau ruang analisa.

Ruang kultur biasanya merupakan ruang yang terbesar dari ruang laboratorium dan harus dipikirkan kemungkinan perluasan. Ruang persiapan dan ruang transfer tergantung dari jumlah dan besar alat-alat, sedangkan ruang stok merupakan ruangan terkecil dan tergantung dari macam pekerjaan, kadang-kadang dibutuhkan ruang mikroskop dan/atau ruang analisa. Ukuran tiap ruangan sangat tergantung dari: A. Alat-alat yang dipergunakan; B. Jumlah personalisa yang terlibat; C. Tujuan pekerjaan; D. kapasitas produksi; E. Biaya yang tersedia.
Ruangan laboratorium harus dijaga tetap bersih, serta bebas dari hewan kecil seperti tikus dan insek (lalat, semut, kecoa dan lain-lain). Sarana dasar seperti : aliran listrik yang cukup, air yang lancar, dan gas, merupakan perlengkapan yang dapat dikatakan harus dimiliki.







Ruang ini merupakan bagian pusat kegiatan laboratories dimana sebagian besar aktifitas kegiatan dikerjakan diruang ini. Aktifitas-aktifitas yang dikerjakan disini antara lain mempersipakan media kultur dan bahan tanaman yang akan dipergunakan, sebagai tempat mencuci alat-alat laboratorium dan tempat menyimpan alat-alat gelas. Fasilitas yang dibutuhkan dalam ruangan ini adalah meja tempat meletakkan alat-alat pemanas, meja untuk alat-alat timbang, meja untuk bekerja dan tempat mencuci.
Persiapan media meliputi penimbangan bahan, pengenceran media, penuangan ke dalam wadah kultur dan sterilisasi. Persiapan bahan tanaman meliputi pencucian kotoran-kotoran dari lapangan, pembuangan dan pemotongan bagian-bagian yang tidak diperlukan serta perlakuan awal untuk mengurangi sumber kontaminasi yang ada pada permukaan bahan tanaman.

Peralatan yang diletakkan dalam ruangan ini terdiri dari :
1. Timbangan analitik timbangan makro.
2. Refrigerator , Freezer dan desikator.
3. Hot plate yang dilengkapi stirrer atau kompor gas
4. Stirrer dengan magnetic stirrer.
5. Autoklaf vertical atau horizontal.
6. Microwave oven.
7. pH meter.
8. agar dispenser.
9. Oven.
10. Destiltor
11. Water bath yang dilengkapi pengatur temperatur
12. Centrifuge dan Vortex
13. Alat-alat gelas standard, antara lain: labu takar berbagai ukuran, pipet biasa dan mikro pipet, erlenmeyer berbagai ukuran (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml), gelas piala berukuran (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml), pengaduk gelas, wadah kultur : botol, tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur dalam berbagai ukuran.
17. Alat untuk mencuci.
18. Rak-rak pengering.
19. Lemari alat-alat, bahan kimia, serta bahan-bahan lain (alumunium foil, kertas timbang, karet gelang dan sebagainya).
20. Alat-alat kecil: spatula, pisau , scalpel dan pinset.
21. Fume hood (ruang asam)
22. Hood tempat penimbangan bahan-bahan yang carcinogenic.
23. Kereta dorong (cart) untuk memudahkan pemindahan alat-alat dan media dari ruang satu ke ruang lainnya.

Baca Selengkapnya...

Landasan dan Tipe Kultur Jaringan

Landasan kultur jaringan didasarkan atas tiga kemampuan dasar dari tanaman, yaitu:
1. Totipotensi adalah potensi atau kemampuan dari sebuah sel untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman secara utuh jika distimulasi dengar benar dan sesuai. Implikasi dari totipotensi adalah bahwa semua informasi tentang pertumbuhan dan perkembangan suatu organisme terdapat di dalam sel. Walaupun secara teoritis seluruh sel bersifat totipotensi, tetapi yang mengekspresikan keberhasilan terbaik adalah sel yang meristematik.
2. Rediferensiasi adalah kemampuan sel-sel masak (mature) kembali menjadi ke kondisi meristematik dan dan berkembang dari satu titik pertumbuhan baru yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu melakukan reorganisasi manjadi organ baru.
3. Kompetensi menggambarkan potensi endogen dari sel atau jaringan untuk tumbuh dan berkembang dalam satu jalur tertentu. Cantohnya embrioagenikali kompeten cel adalah kemampuan untuk berkembang menjadi embrio funsional penuh. Sebaliknya adalah non-kompeten atau morfogenetikali tidak mempunyai kemampuan.



Tipe-tipe Kultur Jaringan


Kultur jaringan (tissue culture) sampai saat ini digunakan sebagai suatu istilah umum yang meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang umumnya tembus cahaya. Sering kali kultur aseptik disebut juga kultur in vitro yang artinya sebenarnya adalah kultur di dalam gelas.
Dalam pelaksanaannya dijumpai beberapa tipe-tipe kultur, yakni:
1. Kultur biji (seed culture), kultur yang bahan tanamnya menggunakan biji atau seedling.
2. Kultur organ (organ culture), merupakan budidaya yang bahan tanamnya menggunakan organ, seperti: ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian daun, bunga, buah muda, inflorescentia, buku batang, akar dll.
3. Kultur kalus (callus culture), merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya.
4. Kultur suspensi sel (suspension culture) adalah kultur yang menggunakan media cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem.
5. Kultur protoplasma. eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).
6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman, yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora), tepungsari/ pollen (kutur pollen), ovule (kultur ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid.

Baca Selengkapnya...