KULTUR ORGAN DAN KULTUR MERISTEM (MIKROPROPAGASI)

Kultur Organ

Teknik kultur jaringan semakin berkembang dan popular sebagai salah satu alternatif dari propagasi tanaman vegetatif. Teknik ini meliputi metode propagasi aseksual dan tujuan utamanya adalah membuat tanaman lebih unggul. Kesuksesan dari beberapa seleksi in vitro dan manipulasi genetic pada tanaman tingkat tinggi tergantung pada kesuksesan dari regenerasi tanaman in vitro.

Keberhasilan pertama dalam kultur in vitro dicapai dalam praktek kultur organ. Menurut Shabde – Moses & Murhasige (1979), Hannig, pada tahun 1904 telah berhasil mendapatkan kecambah tanaman jenis crucifer dari embrio-embrio yang diisolasi dari biji yang belum matang (immature). Pertumbuhan organ yang tidak terbatas didalam kultur in vitro, pertama diperlihatkan oleh White dalam kultur akar tomat sekitar tahun 1934.

Kultur organ merupakan topik yang penting dalam penelitian antara tahun 1940-1960. Setelah itu penalitian dalam bidang ini berkurang, kecuali kultur pucuk/meristem. Kultur pucuk atau maristem mempunyai aspek praktis sebagai cara perbanyakan klon yang cepat dan bebas penyakit. Dewasa ini kultur maristem sudah merupakan tindakan komersial yang dikelola oleh perusahaan –perusahaan pembibitan.

Disamping kultur pucuk, pada tahun 60 an, kultur akar mendapat perhatian lagi pada beberapa tanaman tertentu sehubungan dengan tujuan produksi bahan sekunder, terutama untuk jenis-jenis persenyawaan yang berasosiasi dengan akar. Namun kultur akar yang pertumbuhannya tidak terbatas tersebut, dewasa ini pada umumnya dipusatkan pada hasil transformasi dengan Agrobacterium rhizogenes yang merupakan kultur auksin autotroph.
Secara keseluruhan kultur organ dalam ilmu fisiologi dipergunakan dalam studi diferensiasi dan fungsi dari jaringan-jaringan khusus. Kebutuhan nutrisi dan lingkungan, dapat dieksplorasi antara lebih tepat dalam kultur in vitro. Organ-organ tanaman yang sering digunakan sebagai eksplan tergangtung dari jening tanamannya, organ tersebut antara lain adalah:

1. Jaringan meristem,
8. Helaian daun,
2. Pucuk,
9. Tuber rhizogenum
3. Pucuk kormus,
10. Tuber caulogenum
4. Buku kormus,
11. Inflorescentia,
5. Buku bulb
12. Mata Tunas samping
6. Buku batang tunggal,
13. Hipokotil dan epikotil
7. Ruas batang muda,
14. Akar

KULTUR MERISTEM

Kultur meristem (meristem culture) adalah kultur jaringan tanaman dengan menggunakan eksplan berupa jaringan-jaringan meristematik. Jaringan meristem yang digunakan dapat berupa meristem pucuk terminal atau meristem tunas aksilar. Dalam kultur meristem, perkembangan diarahkan untuk mendapatkan tanaman sempurna dari jaringan meristem tersebut dan dapat sekaligus diperbanyak.
Kultur meristem, sudah secara luas diterapkan untuk tujuan perbanyakan tanaman, terutama pada tanaman hortikultura. Sel-sel meristem pada umumnya stabil, karena mitosis pada sel-sel meristem terjadi bersama mericloneengan pembelahan sel yang berkesinambungan, sehingga ekstra duplikasi DNA dapat dihindarkan. Hal ini menyebabkan tanaman yang dihasilkan identik dengan tanaman donornya.

Selain dari perbanyakan, aplikasi kultur meristem yang terutama adalah eliminasi virus dari bahan tanaman dan penyimpanan plasma nutfah yang bebas virus ini dengan teknik Cryopreservation : preservasi dengan temperatur rendah (Kartha, 1981 dalam Gunawan 1988). Merurut Gautheret (1982 dalam Gunawan 1988), kultur meristem dan eliminasi virus, sejarahnya dimulai dari Stanley seorang biochemist yang menganjurkan White yang pada waktu itu bekerja dengan kultur akar tomat untuk menumbuhkan virus dalam akar yang di-isolir. Dalam subkultur, ada akar yang tidak mengandung virus, terutama bila eksplan yang diambil sangat kecil. Pada tahun 1952 Morel dan Martin berhasil memperoleh tanaman dahlia yang bebas virus dan kemudian berkembang pada banyak tanaman-tanaman lain.
Pada tahun 1960 Morel yang mencoba membebaskan tanaman Cymbidium dari virus, bahkan mendapatkan hasil yang merupakan dasar perbanyakan komersial sekarang. Kultur meristem Cymbidium, Morel dapat menghasilkan perbanyakan diri secara cepat. Tanaman yang dihasikan tersebut merupakan perkembangan dan pertumbuhan dari jaringan vegetatif, maka plantula yang dihasilkan merupakan suatu klon. Tanaman yang dihasilkan dari kultur meristem yang berupa klon sering disebut mericlone. Tahapan pertumbuhan dari kultur meristem Cymbidium dimulai dari terbentuknya kalus terlebih dahulu kemudian disusul terbentuknya protocorm (yaitu suatu struktur serupa dengan perkembangan awal dari perkecambahan biji anggrek yang sebelum tumbuh menjadi tanaman yang sempurna, menggerombol menjadi suatu massa protocorm. Bila massa protocorm tersebut dipisah-pisahkan dan ditumbuhkan di media serupa yang baru maka akan memperbanyak diri menjadi massa protocorm yang baru. Bila protocorm dipindahkan pada media lain yang mengarah pada pendewasaan dan perakaran maka protocorm akan tumbuh menjadi tanaman baru yang sempurna dan siap dipindah ke lapangan.
Hasil yang diperoleh Morel ini tidak hanya membuat revolusi dalam bidang peng-anggrekan, tetapi juga memberikan dorongan dalam perbanyakan cepat tanaman jenis lain. Murashige juga memberikan landasan bahwa kultur meristem dan kultur pucuk dapat digunakan sebagai teknik perbanyakan tanaman hortikultura. Sudah sekitar 10 tahun Murashige bekerja untuk mengembangkan teknik-teknik yang standard untuk beberapa jenis tanaman hias sampai tanaman buah-buahan. Metode yang digunakan untuk berbagai tanaman ini berbeda dengan anggrek. Penggunaan auksin dan sitokinin diperlukan dalam kultur-kultur yang kemudian dikembangkan. Bila Morel memperoleh banyak tanaman baru dari meristem pucuk anggrek dengan melewati proses pembentukan kalus terlebih dahulu, maka Hussey dan Stacey (1980 dalam Gunawan 1988) memperoleh tanaman baru kentang dengan teknik lain. Jutaan tanaman kentang baru diperoleh dalam jangka waktu yang cukup singkat yaitu sekitar satu tahun. Tunas kentang yang bebas virus dijadikan sebagai eksplan awal. Mula-mula satu tunas pucuk atau tunas ketiak kentang ditumbuhkan dalam media perbanyakan, sehingga tumbuh menjadi buku-buku yang masing-masing mengandung satu tunas ketiak. Selanjutnya setiap empat minggu, tunas itu dipanen dan dipotong-potong menjadi buku-buku tunggal atau beberapa buku (3-4 buku) untuk dukulturkan lagi ke dalam media baru. Demikian seterusnya 4 minggu dilakukan kultur berulang.
Perbanyakan vegetatif yang menggunakan eksplan yang telah terinfeksi virus akan menjadi penyebab tersebarnya virus dalam anakan (progeni) di lapangan. Penularan melalui benih sering terjadi pada tanaman Fabaceae seperti buncis, ercis, dan kedelai.
Perkembangbiakan virus sangat tergantung pada metabolisme sel tnaman inang, antara virus dan sel inang terdapat hubungan yang erat. Proses eliminasi virus melalui cara-cara kemoterapi tidak selalu berhasil. Cara yang paling efisien adalah menggunakan kultur meristem. Beberapa contoh tanaman yang berhasil dibersihkan dari virus dengan kultur meristem ditampilkan pada tabel berikut ini:


Teknik Isolasi Meristem
Peralatan:
LAF
Mikroskop binokuler dengan lampu
Pinset berujung runcing
Skalpel dan jarum suntik
Bahan:
Biji kedelai
Biji kedelai dikecambahkan secara aseptik
Media MS + 0,1 μm BA + 1,0 μm NAA (dapat menginduksi meristem menjadi tanaman lengkap).
Cara kerja:
Biji kedelai disterilkan dengan merendam ke dalam alkohol 70% selama 1 menit, dipindahkan kedalam 20% clorox selama 15 menit- 20 menit sambil digoyang, selanjutnya dibilas menggunakan aquadest steril 4x untuk menghilangkan sisa-sisa cloroxnya.
Biji tersebut dimasukkan ke dalam aquadest steril dan direndam selama 5-6 jam.
Biji-biji tersebut ditanam pada media MS dalam tabung reaksi 18x2,5 cm.
Kecambah umur 1 minggu diisolasi meristemnya dibawah mikroskop binokuler (yang telah disterilkan dengan alkohol 70%) pada perbesaran 20x10.
Organ daun dibuang secara hati-hati menggunakan skalpel atau jarum sampai terlihat meristem yang berbentuk kubah (dome). Dengan jarum atau ujung scalpel, dibuat irisan dengan bentuk V dengan ukuran 0,2-0,3 mm dan langsung meristem dimasukkan ke dalam media kultur yang telah disediakan.
Botol kultur diletakkan pada inkubator pada suhu 25-27oC dengan penyinaran selama 16 jam/hari.

Meristem Kentang
Persiapan bahan tanaman:
a. Umbi kentang yang mempunyai bobot 30 g/ buah atau umbi yang besar yang dipotong dengan berat 20 g/potong dengan beberapa mata.
b. Umbi direndam dalam 0,03 μm GA3 selama 1 jam.
c. Umbi diletakan pada pasir yang lembab.
d. Tunas yang 3-5 cm dipergunakan sebagai bahan awal.
Isolasi meristem:
Tunas dicuci bersih menggunakan detergen dan disterilkan dalam larutan clorox 20% selama 7 menit, direndam lagi dalam larutan clorox 10% selama 10 menit, selanjutnya dibilas menggunakan aquadest steril. Tunas dipindahkan pada petri-dish steril.
Tunas diambil bagian jaringan meristem dengan cara seperti pada pengambilan jaringan meristem pada kedelai.
Media yang digunakan adalah MS + 1 g/L Bacto-tryptone.
Botol kultur disimpan dalam inkubator pada suhu 25 oC, panjang penyinaran 12 jam /hari, intensitas cahaya 150 lux selama 7 minggu.
plantula yang telah dihasilkan diuji dengan ELISA test.
Bila telah bebas virus, plantula dapat disubkultur dengan memotong-motong 1 buku/ eksplan, dipindahkan ke madia MS + 0,001 mg/L dan diulangi prosedur tiak 20 hari, untuk mendapatkan plantula dalam jumlah banyak.


Kultur Meristem Anggrek Cymbidium

Cymbidium dapat dikulturkan pada beberapa media, seperti: media Vacint & went, Muller & Morel, MS ½ atau Knudson C. Tanaman ini dapat ditanaman dalam media cair (botol kultur diletakan di atas shaker dengan pengocokan) ataupun padat dengan penambahan agar 0,8%.
Isolasi bahan tanam:
Pucuk Cymbidium dipotong sepanjang 3 cm, kemudian daun-daun yang menyelubungi dibuang.
Pucuk direndam dalam alkohol 70% selama 2 menit dilakukan dua kali kemudia dibilas dengan air steril.
Pucuk direndam ke dalam larutan clorox 20% selama 5 menit, bilas dengan air steri 2-3 kali dan selanjutnya direndam kembali ke dalam larutan clorox 10% selama 10 menit.
Pucuk dibilas menggunakan aquadest steril, selanjutnya diletakkan pada cawan petri steril.
Jaringan meristem yang berbentuk kubah (dome) diambil sekitar ukuran 0,5 mm dari titik tumbuh dengan 2 calon daun.
Jaringan meristem diletakkan di dalam air steril dalam petri-dish. Jaringan tersebut kemudian dipindahkan pada media dalam botol kultur.
Tahapan kultur:
Kultur meristem anggrek dapat dibagi menjadi 3 tahap yang berkesinambungan, yaitu:
a. Inokulasi eksplan dan pembentukan protocorm awal.
b. Perbanyakan protocorm.
c. pembentukan calon tanaman sempurna (plantula).
Pada tahap pertama, eksplan diinokulasikan ke dalam media cair, selanjutnya botol kultur dikocok terus menerus menggunakan shaker, hingga eksplan membentuk massa protocorm, shaker diletakkan pada ruangan yang bersuhu 22oC dengan pencahayaan sekitar 100 f.c.
Tahap kedua, melakukan perbanyakan protokorm, yaitu dengan memotong-motong protocorm dan dipindahkan ke media segar. Tahap ke dua memerlukan waktu 2 bulan. Media yang digunakan dan pengocokkan dilakukan sama seperti pada tahap pertama.
Tahap ketiga adalah memperoleh calon tanaman sempurna (bibit) yaitu dengan perakaran tunas. Protocorm dari tahap ke dua dipanen dan diambil yang berukuran 0,5 cm (satu eksplan satu protocorm). Protocorm yang masih belum mencapai ukuran ditinggalkan dalam botol kultur untuk diperbanyak lagi. Protocorm dewasa dipindahkan dalam media padat, sehingga membentuk tunas dan akar. Bila plantula telah terbentuk sempurna dapat diaklimatisasi untuk dipindahkan ke lapangan