Teknik Sterilisasi Eksplan

Dalam kultur jaringan, inisiasi kultur yang bebas dari kontaminan merupakan langkah yang sangat penting. Bahan tanaman dari lapangan mengandung debu, kotoran-kotoran, dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau serta spora-spora. Bila kontaminan ini tidak dihilangkan, maka pada media yang mengandung gula, vitamin dan mineral, kontaminan terutama cendawan dan bakteri akan tumbuh secara cepat. Dalam beberapa hari, kontaminan akan memenuhi seluruh botol kultur. Eksplan yang tertutup kontaminan akhirnya mati, dapat sebagai akibat langsung dari serangan cendawan/bakteri.

Pada beberapa jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari dalam jaringan tanaman, terutama bakteri. Bakteri-bakteri ini sampai sekarang belum diidentifikasi. Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah. Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida yang sistemik.

Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminan permukaan yang berbeda, tergantung dari :
1. Jenis tanamannya.
2. Bagian tanaman yang dipergunakan.
3. Morfologi permukaan (misalnya: berbulu atau tidak).
4. Lingkungan tumbuhnya (green house atau lapangan)
5. Musim waktu mengambil (musim hujan/kemarau).
6. Umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa).
7. Kondisi tanamannya (sakit atau dalam keadaan sehat).

Keadaan ini menyulitkan penentuan suatu prosedur sterilisasi standard yang berlaku untuk semua tanaman. Juga sukar untuk menentukan prosedur standard yang dapat dipergunakan untuk suatu jenis tanaman yang berasal dari tempat berbeda. Setiap bahan tanaman harus ditentukan melalu percobaan pendahuluan.

Dalam sterilisasi bahan tanaman, hal yang penting yang harus mendapat perhatian adalah bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama-sama benda hidup. Kontaminasi harus dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman. Di negara-negara tropis, kontaminasi permukaan ini biasanya merupakan hal yang cukup serius, sehingga beberapa tahap sterilisasi harus dilakukan.

Teknik Sterilisasi Eksplan

Beberapa jenis bahan yang dapat dipergunakan dalam sterilisasi permukaan eksplan, antara lain adalah:

Tabel 7. Macam- macam sterilan, kisaran konsentrasi dan lama waktu perendaman :
No.
Bahan
Konsentrasi
Lama Perendaman
1
Kalsium hipoklorid
1-10%
5-30 menit
2
Narium hipoklorid
1-2%
7-15 menit
3
Hidrogen peroksida
3-10%
5-15 menit
4
Gas Klorin
-
1-4 jam
5
Perak nitrat
1%
5.30 menit
6
Merkuri klorid
0.1-0.2%
10-20 menit
7
Betadine
2.5-10%
5-10 menit
8
Benlate
2 gram/l
20-30 menit
9
Antibiotik
50 mg/l
½-1jam
10
Alkohol
70%
½-1 menit

Bahan-bahan sterilisasi ini, pada umumnya bersifat toxic terhadap jaringan tanaman. Pembilasan yang berkali-kali sesudah perendaman didalam larutan sterilisasi. Sangat perlu dilakukan untuk menghilangkan sisa-sisa bahan aktif yang menempel di permukaan bahan tanaman. Dalam sterilisasi, kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan sterilisasi misalnya: perendaman dalam alkohol dulu, kemudian dalam natrium hipoklorid dan dibilas. Dapat juga perendaman dimulai dengan larutan fungisida atau antibiotik, kemudian baru merkuri klorid, dan dibilas dengan air steril. Prosedur sama yang paling efektif, harus ditentukan melalui percobaan pendahuluan.

Sterilisasi bahan tanaman (misalnya: tunas kentang atau kencur), dimulai dengan pencucian dan pembuangan bagian-bagian yang kotor dan mati di bawah pancuran air ledeng. Pencucian dapat dilakukan dengan menggunakan detergen lembut. Kadang-kadang bahan yang sudah bersih, dibiarkan dibawah pancuran air selama 1.2-1 jam untuk memecahkan koloni kontaminan pertaminan permukaan, agar koloni-koloni tersebut peka terhadap bahan-bahan sterilisasi (Gunawan, 1988).

Bahan yang sudah bersih dikecilkan sampai ukuran tertentu. Ukuran ini harus lebih besar dari ukuran eksplan yang direncanakan. Bahan kemudian direndam dalam larutan fungisida dan/atau antibiotic. Setelah waktu perendaman tercapai, bahan ditiriskan dan dibawa masuk ke dalam laminar air flow cabinet. Prosedur lain dijalankan di dalam laminar air flow cabinet. Bahan-bahan tanaman dicelup dulu selama ½ menit dalam alcohol 70%, kemudian dimasukkan kedalam larutan natrium/kalsium hopoklorit yang diberi beberapa tetes bahan surfactant sepertti Tritone-x, Tween 20, atau Tween 80. Setelah waktu perendaman dalam larutan natrium/kalsium hipoklorid tercapai, bahan tanaman dibilas 3 kali dalam aquadest steril selama 10 menit untuk tiap pembilasan. Setelah semua prosedur tersebut dijalankan, berarti bahan tanaman sudah siap untuk ditanam.

Masing-masing peneliti dan laboratorium dapat mengembangkan sendiri, cara yang paling efektif untuk keadaan setempat.

Dalam laboratorium yang mempunyai pompa vacuum, sterilisasi dapat dilakukan dalam keadaan vacuum dan dikocok dengan meletakkan botol di atas magnetic-stirrer. Hal ini dapat meningkatkan efisiensi sterilisasi. Ke dalam larutan juga ditambahkan surfactant beberapa tetes.

Bila gas klorin yang digunakan, maka prosedur harus dilakukan dalam fume hood atau lemari asam. Gas klorin dapat diperoleh dengan cara: 50 ml Clorox (bahan pemutih komersial/bleach), ditambah dengan 5 ml HCL pekat. HCL pekat tidak ditambahkan sekaligus, tetapi mula-mula 3 ml dulu, sesudah 3 menit dapat ditambahkan yang 2ml. Bahkan tanaman yang akan disterilkan misalnya umbi kentang dan wadah yang berisi Clorox + HCL dimasukkan ke dalam botol besar yang tertutup

Untuk menghindarkan pemborosan media perlakuan , bahan tanaman tidak langsung ditanam di dalam media perlakuan . Eksplan terlebih dahulu di tanam di dalam media preconditioning yang merupakan media komposisi dasar tanpa hormone, untuk menguji keefektifan prosedur sterilisasi. Setelah 3 – 7 hari di dalam media pre-conditioning dan tidak menunjukkan gejala kontaminasi yang berlebih-lebihan, sebaiknya dibuang. Untuk eksplan yang sukar diperoleh dan masih menunjukkan intergritas yang baik setelah sterilisasi pertama, sterilisasi kedua dapat dilakukan bila kontaminasi masih muncul di permukaan.

Dalam kasus kontaminasi internal, langkah yang dapat diambil adalah perendaman bahan tanaman yang sudah dicuci bersih, didalam larutan antibiotik selama 4 – 5 jam. Kemudian prosedur selanjutnya, sama dengan sterilisasi permukaan bahan tanaman yang lain. Tindakan ini menolong keadaan tanman dengan kontaminan internal yang berupa bakteri. Cara lain yang dapat ditempuh, adalah menambahkan antibiotic yang tepat kedalam media tumbuh. Apabila antibiotik yang digunakan termasuk yang heat-labile, maka antibiotik tidak dimasukkan ke dalam media sebelum sterilisasi dengan autoklaf. Media di autoklaf tersendisi dan antibiotic ditambhkan setelah difiltrasi dengan micro-filter dengan pori-pori 0.2 um.